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Die vorliegende Dissertation sollen auf zwei wichtige Punkte aufmerksam machen, die in Lehr- und Schulbüchern teilweise falsch sind:
  1. Die Differenzierung von Zellen und ihre Organellen ist aller Wahrscheinlichkeit nach ein Vorgang von Schwingungen, bei denen die Proteine (Apoenzyme) durch ihre Länge und Form die Relaxation bestimmen. Diffusionsgradienten können dabei durchaus eine Rolle spielen, sind aber oft nicht ausreichend präziese genug. Nach dieser Vorstellung hat man sich Zellen und Organellen als dreidimensionale Chaldni'sche Klangfiguren vorzusellen, in denen Schwingungsbäuche und Schwingungsknoten Orte der Bewegung bzw. der erhöhten Reaktion sind. Diese Vorstellung erlaubt es zu verstehen, wie es kommen kann, daß Zellwände von beiden Seiten gleichzeitig lytisch angegriffen werden. Die in Lehrbüchern gemachte Angabe, daß Plasmodesmen und Tüpfel dadurch entstehen, daß beim Aufbau der Zellwand die Plasmodesmen ausgespart werden, reicht zur Erklärung dieser Zellkommunikation nicht aus, weil es beim Streckungswachstum zu einer Verarmung an Plasmodesmen käme. Die Vorstellung, daß Moleküle und Molekülverbände mit korrespondierender Frequenz bevorzugt in Reaktion miteinander treten, wird von der Strukturmechanik gestützt (in gepackter Form etwa 560 KB).
  2. Die osmotische Gewebespannung, so wie sie in Schul- und Lehrbüchern dargestellt wird, vernachlässigt meist die Spannung unter der Zellen normalerweise stehen, und die erst bei Plasmolyse sichtbar wird. Die unterschiedliche Dehnbarkeit von Bastzellen erklärt deren statische Bedeutung.
(Fehler bei der Digitalisierung des Textes bitte ich zu entschuldigen bzw. mir mitzuteilen.)
Prof. Dr. Walther Umstätter

ÜBER DIE DIFFERENZIERUNG VON ZELLVERBÄNDEN AUS DAUCUS CAROTA L.

AUF SYNTHETISCHEN NÄHRMEDIEN.

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung der Doktorwürde, vorgelegt dem Fachbereich Biologie der Freien Universität Berlin, von Dipl. -Biol.
WALTHER UMSTÄTTER
geboren in Ploesti (Rumänien)

Inhalt

A.  Einleitung
B.  Material und Methode
     Abkürzungen
C. Ergebnisse
     I Wachstum der Explantate
       1. Frischgewichtszunahme
       2. Größenzunahme der Zellen
       3. Zellteilungsaktivität
   II Osmolalität und Saugkraft der Gewebe
       1. Kryoskopische Bestimmung
       2. Grenzplasmolytische Bestimmung
  III Dissimilation der Explantate
       1. O2-Verbrauch und CO2-Produktion
       2. Der Respiratorische Quotient
       3. Gasversorgung der Gewebe
  IV Aktivität und Verteilung der Enzyme in den Explantaten
       1. Die Dehydrogenasen
       2. Die Oxidasen
       3. Die Phosphatasen
       4. Die Esterasen
   V Analyse der Explantate und des Mediums
       1. Stärke und Zucker
       2. Proteine
       3. DNS
       4. Eiseniohen
       5. Ascorbinsäure
       6. Karotinoide
       7. Wasserstoffionen
  VI Histologische Untersuchungen
D. Diskussion
E. Zusammenfassung
F. Literaturverzeichnis
 

Einleitung

Pflanzliche und tierische Gewebe entstehen durch Differenzierungsprozesse ihrer Untereinheiten, den Zellen, die durch ihre Wechselbeziehungen kontrolliert werden. Daraus ergibt sich die Frage nach der Totipotenz der Zellen im Verband. Die entsprechend notwendigen Versuche, bereits von HABERLANDT 1902 eingeleitet, und seit den Erfolgen GAUTHERET's 1939 in den Bereich des Möglichen gerückt, wurden 1958 von REINERT, durch die gesteuerte de novo Bildung von Embryonen in vitro, erstmals erfolgreich durchgeführt.

Damit war die Voraussetzung geschaffen, begrenzte Zellverbände aus ihrer räumlichen und korrelativen Hemung herauszunehmen und in Abhängigkeit exakt bestimmbarer Umweltfaktoren, ihre veränderten Potenzen, sowie die entsprechenden Umdifferenzierungen, genau in studieren.

Seit SACHS (1874) verstehen wir unter Differenzierung die von einem Meristen ausgehende Entwicklung in den strukturell und funktionell unterschiedlichen Dauergeweben. D geht nach JOST (1923) mit der Arbeitsteilung die physiologische Selbständigkeit der Zellen verloren, wodurch die Lebensfähigkeit nur im Verband des differenzierten Ganzen bestehen bleibt.  Auf die damit verbundene "innere Verkettung und wechselseitige Beeinflussung in selbstregulatorischer Weise für das harmonische und zweckentsprechende Zusammenwirken der Organe der Pflanze und der Zellen eines Organes" hat PFEFFER (1904) hingewiesen. PFEFFER vertrat dabei die Ansicht, "daß also die Ontogenese, um mit DRIESCH zu reden, eine epigenetische Evolution vorstellt". In diesem Zusammenhang sei erwähnt, daß ZIMMERMANN (1953) das "Rosasche Differenzierungsgesetz" durch seinen Vergleich der verschiedenen Zell.typen, im Laufe der Phylogenese, präzisiert hat und dabei etwa 70 Zellsorten bei den höheren Pflanzen unterscheidet.

Die Frage, wie weit Differenzierungen reversibel sind, wurde von WEISS (1949) einer näheren Betrachtung unterzogen. Dabei sollten definitionsgemäß im Gegensatz zur Modulation,Differehzierungen permanent bestehen bleiben, also auch bei Verlust des initiierenden Faktors. Eine weitere Unterscheidung trifft HOLTZER (1968) bei biochemisch differenzierten Zellen. Neben der Produktion essentielles Moleküle, die in allen Zellen benötigt werden, sind sogenannte "luxury molecules" die Bausteine, welche die Differenzen der Zellen deutlich zeigen sollen. HOLTZER konnte 1973 an tierischem Material nachweisen, daß eine molekulare Information, die von der Mutterzelle nicht aufgenommen werden konnte, in der Tochterzelle zu entsprechenden Veränderungen führte. Er kommt zu dem Schluß, daß als Voraussetzung für die Differenzierung die Zell- bzw. Kernteilung anzusehen ist.

Diese Erscheinung ist auch bei niederen Pflanzen zu beobachten, bei denen durch differentielle Zellteilung Unterschiede, z.B. im Generationswechsel, entstehen. Bei höheren Pflanzen entscheidet dagegen meist das "Gesetz der Lage", die sogenannte modifikatorische Differenzierung. Es werden dabei nach MOHR (1971) zwei Phasen unterschieden: Die primäre Differenzierung, sie entspricht in etwa der Determinationsphase, und die sekundäre Differenzierung, sie entspricht in etwa der Aktivierungsphase.

Betrachtet man die, in der "Biogenetischen Grundregel" (HAECKEL 1866) enthaltene Erkenntnis MÜLLER'S (1864), so spiegelt sich in ihr die Tatsache wieder, daß in der Ontogenese wie in der Phylogenese jede Phase der Entwicklung von der Einzelzelle bis zum erwachsenen Organismus lebensfähig sein muß. Somit ist das System also stabil und steht trotz veränderlicher Umwelt und epigenetischer Entwicklung, jederzeit korrelativ unter Kontrolle. Die höhere Pflanze, ist ein sich
ständig in physiologischen Grenzen variierendes, und sich optimierendes System, deren differenzierte Gewebe sich gut isolieren, kultivieren und analysieren lassen.

Die gezielte Veränderung der Umwelt, im Rahmen der physiologisch möglichen Grenzen der Zellverbände, ist für die Klärung dieses Problemkreises eine wesentliche Voraussetzung.

Durch die Explantation von Geweben gewünschter Größe, auf genau bestimmte synthetische Nährmedien, soll hier die Frage nach der Abhängigkeit der Differenzierungs-und Wachstumsvorgänge untersucht werden. Dies war auch das Ziel HABERLANDTIS, der bereits 1902 versucht hatte, Aufschlüsse "über die Wechselbeziehungen und gegenseitigem Beeinflussungen, denen die Zellen innerhalb des vielzelligen Organismus ausgesetzt sind", zu gewinnen Die vorliegende Untersuchung ve rfolgt dieses Ziel an dem Objekt Daucus carota L.
 

Material und Methode

1. Kultivierung und Bestimmungen zum Wachstum

Die untersuchten Explantate entstammten dem oberen Drittel der Rübe von Daucus earota L. ssp. sativus var. "Rote Riesen". Dabei kamen möglichst frisch geerntete Exemplare zur Verwendung, die bei 40C in Plastiktüten, gelagert waren. Auf weitere Objekte die zum Vergleich herangezogen wurden, wird an entsprechender Stelle eingegangen.

Zur Oberflächensterilisierung sind die geschälten Rüben für 45 min in Kalziumhypochloridlösung, etwa 2%ig an Chlor (JAMES 1915), getaucht worden. Die Explantation erfolgte unter aseptischen Bedingungen (GAUTHERET 1959), auf 10 ml 0,8%igen Schrägagar in Kulturröhrchen mit Aluminiumfolie, bzw. in Anumbra Petrischalen (5 cm0) mit Parafilm verschlossen. Bei Suspensionskulturen dienten Erlenmeyerkolben, mit 50 U/min geschüttelt, als Behälter. Die Kulturen wurden in einer Phytokammer bei 28 1 loC, 80%iger relativer Feuchte und Dunkelheit gehalten und in 4-wöchigem Rhythmus übertragen.
Als Medien kamen daevon  WHITE (1954) und das von MURASHIGE und SKOOG (1962) mit den "plant organics" nach WHITE zur Verwendung. Nähere Angaben hierzu bei REINERT, BACKS und KROSING (1966). Neben 2% Saccharose enthielten die Medien 5 . 10-8 g/ml 2,4-Dichlorphenoxiessigsäure (254-D); bei Kultivierung von Monokotylen betrug der 2,4-D Gehalt das zwanzigfache. Der pH Wert wurde mit Natronlauge auf 5,8 eingestellt. Durch 20 min Autoklavierung bei 1 Atü konnten Infektionen im Medium ausgeschlossen werden.

Die Explantate, zumeist der Kambiumregion entnommen, ließen sich leicht mit einem Korkbohrer ausstechen und je nach Ausgangsgröße mit keimfreien Rasierklinge oder Skalpell zurechtschneideri. Dies gelang bis zu Geweben von weniger als zwanzig Zellen.

Kulturen, deren Frischgewicht bestimmt werden sollte, wurden rasch mit aqua dest. von den anhaftenden Agar-Resten befreit, sofort mit "Kleenex" abgetupft und auf einer Feinwaage auf Milligramm genau gewogen. Dabei wurden auf einen gleichmäßigen und raschen Ablauf der Versuchsbedingungen geachtet. Zur Trockengewichtsbestimmung wurden die Gewebe lyophilisiert.
Veränderungen der Zellgröße, die meist mit Formänderungen einhergehen, sind quer zur optischen Achse des Mikroskops, mit Hilfe eines Okularmikrometers, im Längs-, Quer- und Tangentialschnitt gemessen worden. Ähnlich wurde bei der Bestimmung der Zellzahl verfahren. Hier war es wichtig auf eine möglichst geringe Tiefenschärfe zu achten, um nicht Zellen aus unterschiedlichen optischen Ebenen mit zu berücksichtigen.

Die Bestimmung der Mitosen erfolgte nach Behandlung der Kulturen mit frisch angesetzter 0,01%iger Colchicin-Lösung. Dazu kamen die Kulturen für 8h in ein entsprechendes Kulturmedium mit dem Metaphasegift. Anschließend wurden dünne Handschnitte angelegt, die über Nacht in 3 Teilen Carnoy und 1 Teil Orcein - Essigsäüre (Ig Orcein in 100 ml 50%iger Essigsäure) lagen. Die Schnitte mußten anschließend in 1 ml reine Orcein - Essigsäurelösung überführt, und 3 x im Reagenzglas erhitzt werden. Auf einem Objekträger gespreitet, sind Quetschpräparate angefertigt worden, die sofort zur Untersuchung gelangten.
 

2. Bestimmung des osmotischen Wertes und der Saugkraft

Mit dem, für kryoskopische Messungen eingerichteten elektronischen Universal - Temperatur - Messgerät von Knauer, konnten die Extrakte aus den Geweben und Medien bestimmt werden. Dazu waren zu jeder Bestimmung 1,5 ml Extrakt notwendig. Zur Sicherheit wurden die durch mehrere Lagen"Miracloth"abgepreßten Extrakte stufenweise verdünnt, und die jeweils erhaltenen Werte auf den Wert des unverdünnten Extraktes hin extrapoliert. Jede Messung wurde mindestens dreimal überprüft und gemittelt. Zur Eichung des Gerätes diente eine 400 millimolal Natriumchloridlösung.

Bei den grenzplasmolytischen Bestimmungen kamen Handschnitte zur Anwendung, die für 15 min in die Saccharose-Konzentrationsreihe gelangten (20 0 C). Schnitte, deren Plasmolysegrad schwer zu erkennen war, erhielten einen Zusatz von Neutralrot im Verhältnis von 1 : 10.000 (STRUGGER 1949). Die Saccharc)selösungen wurden mit Leitungswasser angesetzt, wobei die Verschiebung des osmotischen Wertes berücksichtigt wurde.

Die Saugkraft ließ sich in Abwandlung der Methode von PRINGSHEIM bestimmen; indem möglichst kleine Kuben aus dem Gewebe geschnitten, kurz mit Leitungswasser abgespült, mit "Kleenex" abgetrocknet und sofort gewogen wurden. Danach lagen sie 1 h in den entsprechenden, vorher evakuierten Saccharase-Lösungen und wurden abermals abgetrocknet und gewogen. Zur Bestimmung des Volumens der Interzellularen ließ sich eine Vakuuminfiltration in äquimolalen Medium anschließen. Die dabei aufgenommene Flüssigkeitsmenge entspricht dem vom Glas erfüllten Raum des Gewebes.
 

3. Die manometrische Methode nach 0. Warburg

Mit dieser Methode konnte die O2-Aufnahme, sowie die CO2-Abgabe (durch absorbierende Kalilauge) der auf dem
Medium wachsenden Kulturen bestimmt werden. Dabei ließen sich mögliche Reizreaktionen durch Veränderung
des Substrates umgehen. Die Messungen wurden bei  28 ± 0,05o C im verdunkelten Raum durchgeführt, um möglichst ähnliche Bedingungen zu erhalten, wie sie in den Kulturgefäßen herrschen.
 
 

4. Enzymatische Bestimmungen

a.) Bestimmungen an Schnitten

Um eine Aussage über die Verteilung der verschiedenen enzymatischen Aktivitäten in den Explantaten (Kantenlänge 5 x 5 x 5 mm) zu gewinnen, wurden diese in Scheiben von 50 m zerlegt. Je nach Aktivität des Gewebes konnte dann der Umsatz an Substrat durch 1 - 3 Scheibchen pro Testansatz bestimmt werden. Die Schnittserien lagen in der Quer-, Tangential- bzw. Längsrichtung des Explantates. Eingebettet wurde, soweit notwendig, in Polyäthlenglykol Type 400 (Serva) bei Vakuuminfiltration. Das Schneiden erfolgte am Gefriermikrotom mit angeschlossenem Kryomaten (Leitz) bei -20° C.

Testansätze:

Alkoholdehydrogenase EC 1.4.1.3

Glutaminsäure-Dehydrogenase EC 1.1.1.1 Lactat-Dehydrogenase EC 1.1.2.3 Saure Phosphatase EC 3.1.3.2

b.) Bestimmungen an Extrakten

Das Gewebe wurde mit Tris - Phosphatpuffer bei pH 6,9 (0,47 M an Tris), 20% Saccharose, l% Polyäthylenglykol und 0,01 M Mercaptoäthanol im eisgekühlten Mörser mit Seesand (Merck p.a.) zerrieben und durch ein Tuch gepreßt. Zentrifugiert wurde 20 min bei 30.000 x g und 30C. Es wurde der klare Oberstand verwendet.

Testansätze:

Bestimmungen der sauren Phosphatase in "Lysosomen", verändert nach MATILE(1968). Zum Vergleich wurde in den Fraktionen auch die Aktivität der Ribonuklease EC 2.7.7.16 mit dem folgenden Testansatz bestimmt.

c.) Histochemische Nachweise

Schnitte von 30m wurden auf einem Gefriermikrotom mit angeschlossenem Kryomaten (Leitz) nach Einbettung in Polyäthylenglykol 1.000 bei -20° C angefertigt. Um Artefakte weitgehend ausschließen zu können, wurden in fast allen Fällen auch Handschnitte zum Vergleich angelegt. Die Inkubation erfolgte bei 37° C auf Objektträgern, in einer ebenen Schale im Thermostaten. Zur Beobachtung wurden die Schnitte kurz abgespült und in Glyzerin gelegt.

Testansätze:

5. Quantitative Bestimmung

6. Zytologische Untersuchungen

Die Sphärosomen konnten nach PERNER im Hellfeld-, Dunkelfeld- und Phasenkontrast Mikroskop identifiziert werden. Ihr Vergleich mit "Lysosomen" gelang auf Grund des Nachweises der sauren Phosphatase und der Esterase. Die "Lysosomen" waren auch mit Neutralrot und Acridinorange vital färbbar und ihre Fluoreszenz bei Blaulicht Erregung mit den Filtern BG 12 und BG 38 gut sichtbar.

Mitochondrien waren in Form und Größe im Phasenkontrast als solche zu erkennen und von den oben genannten Organellen gut abgrenzbar. Zusätzlich konnte bei ausreichender Sauerstoffversorgung mit 0,01%iger Janusgrün-Lösung vitalfluorochromiert werden.

Stärkekörner und Kristalle waren im Polarisationsmikroskop von den anderen Gruppen klar unterscheidbar.
 

Abkürzungen

y = b . x a
oder
log y = log b + a . log x
wobei
a = Konstante; y = Zuwachs/Zeiteinheit; x = Ausgangsgewicht; b = Konstante
bedeutet.

Bei logarithmischer Auftragung muß sich somit eine Lineare ergeben, die sich über eine entsprechende logarithmische Koordinatentransformation als Regressionsgerade berechnen läßt. Das Steigmaß dieser Geraden entspricht dem Exponenten a. der Schnittpunkt mit der Ordinate legt die Konstante b fest.

Für die untersuchten Kulturen ergaben sich damit die Beziehungen:

yW  = 0,482 . x0,682   (für Kulturen auf Mw)
ySW  = 0,550  x0,700    (für Kulturen auf Msw)
yS   = 0,626 . x0,698    (für Kulturen auf Ms).
Die Konfidenzintervalle für die Mittelwerte wurden berechnet und mit eingezeichnet (Abb. 2a-c). Es zeigt sich deutlich, daß die Streuungsbereiche stark Überlappen, wodurch die Darstellungsweise der Abb. 1 gerechtfertigt erscheint.